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谈不合类型试剂盒提取血液基因组DNA后果的比较

  从血液中提取高质量核酸是很多法医和医学诊断的基本,其应用范围包含家畜和人类的HIV、HBV、HCV 和细菌的病原体检测,法医剖断,诊断疾病(如癌症),遗传性疾病及甲基化研究等。
  由于应用范围较大年夜,用于临床诊断和鉴其他DNA 需求也在赓续扩大年夜。DNA 的提取是临床诊断和辨别精确的基本和关键,DNA 的浓度、纯度和质量是其提取成功的关键。在以往的研究中,基因组DNA的提取和纯化是采取主动化程度较低,且耗时耗力的手工提取法,而试剂盒提取血液DNA 的办法具有简便、高效等长处。随着迷信的进步,愈来愈多的临床研究者选择应用试剂盒或主动提取装配代替传统的手工办法提取血液DNA。今朝,最罕见的DNA 提取试剂盒的类型重要包含溶液沉淀法、离心柱法和磁珠吸附法试剂盒等。由于不合研究的目标不合,对血液DNA 的请求不合,血液基因组DNA 提取试剂盒类型的选择成为实验顺利停止的关键,但对这几类血液基因组DNA提取办法停止比较的研究较少。是以,本研究对溶液沉淀法、离心柱法和磁珠吸附法试剂盒提取血液基因组DNA 的后果停止比较,为血液基因组DNA提取筹划的选择供给根据。
  1 材料与办法
  1. 1 重要试剂及仪器DP319 型血液基因组DNA提取试剂盒、主动磁珠法基因组DNA 提取装配、柱型DNA 提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Midi Kit)及2 × Taq PCR MasterMix 均购自天根生化科技(北京)无限公司;ND-1000 紫外分光光度仪(C1000Touch 型PCR 仪)购自美国Thermo 公司;POWERPAC 3000 型电泳仪和凝胶成像仪购自美国BIORAD公司。
  1. 2 血液标本的制备取本中间高血压患者(均为2006 ~ 2015 年出院,诊室血压在140 / 90 mmHg 以上,且诊断为原发性高血压)空肚静脉全血至少1 ml,参加含EDTA 抗凝剂的聚丙烯管中,急速置-80 ℃保存,防止反复冻融。
  1. 3 血液基因组DNA 的提取随机抽取-80 ℃保存的血标本90 份,置4 ℃冰箱住宿;于37 ℃水浴30 min,充分融化后,将血液混匀,分别汲取1 ml 用于检测。将血液标本随机分为3 组,分别采取溶液沉淀法(DP319 型血液基因组DNA 提取试剂盒)、离心柱法(QIAamp DNA Blood Midi Kit)和磁珠法(主动磁珠法基因组DNA 提取装配)提取基因组DNA,严格按各试剂盒解释书停止操作,一切提取办法终究均参加200 μl TB 缓冲液对DNA 停止融化。
  1. 4 基因组DNA 浓度和质量的检测每份DNA样品取2 μl,用无菌水作为空白对比,紫外分光光度计测定基因组DNA 的浓度(ng / μl)、A260 / A280 值及A260 / A230 值,用于评价基因组DNA 的质量。
  1. 5 琼脂糖凝胶电泳检测每份样品取5 μl,参加1 μl loading buffer,恒压120 V 停止0. 7%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像仪不雅察,并摄影。
  1. 6 PCR 剖断根据GenBank 中登录的KCNJ5(3762)第2 外显子的核苷酸序列,应用Primer 3. 0软件设计引物,引物序列以下:上游:5′-ACAACCATTGGGTATGGCTTC-3′,下游:5′-AGGCACAGACCTGCATCTTCT-3′,扩增产品大年夜小为466 bp。PCR 扩增体系为:基因组DNA 1 μl(< 1 μg),上、下游引物各1 μl,2 × Taq PCR MasterMix 12. 5 μl,补加dd H2O至25 μl。PCR 反响条件为:94 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30 个轮回;72 ℃再延长5 min。PCR 产品停止0. 7%琼脂糖凝胶电泳剖断,办法同1. 5 项。
  1. 7 统计学分析应用SPSS 17. 0 统计学软件停止统计学分析。实验计量材料采取均值± 标准差(x ± s)表示,组间差别起首做正态性分析,若实验数据符合正态分布,采取两两比较的t 考验或方差考验,若数据不符合正态分布,采取非参考验,以P <0. 05 为差别有统计学意义。
  2 成果
  2. 1 基因组DNA 浓度及质量紫外分光光度计检测成果注解,溶液沉淀法、离心柱法和磁珠法提取的血液样本DNA 浓度,差别有统计学意义(P < 0. 001);采取正态性考验不符合正态分布,是以应用非正态分布的非参法停止数据的两两比较,溶液沉淀法提取的DNA 浓度明显高于离心柱法和磁珠法,且差别有统计学意义(P 值分别为< 0. 001 和0. 043),离心柱法和磁珠法提取的DNA 浓度差别无统计学意义(P = 0. 074)。3 种办法提取血液样本基因组DNA的A260 / A280 值及A260 / A230 值的差别均无统计学意义(P 值分别为0. 264 和0. 321)。
  2. 2 琼脂糖凝胶电泳检测成果0. 7 %琼脂糖凝胶电泳分析注解,3 种办法提取的血液基因组DNA 都可见约50 000 bp 的目标条带。磁珠法和溶液沉淀法提取的DNA 点样孔处均有发亮景象,有大批拖尾;离心柱法提取的DNA 点样孔处较干净,电泳条带单一,无拖尾。
  2. 3 PCR剖断3 种办法提取的基因组DNA 的PCR产品经0. 7%琼脂糖凝胶电泳分析,都可见466 bp的单一且通亮的目标条带。
  3 评论辩论
  今朝,大年夜量临床分子生物学研究须要应用血液基因组DNA 作为基本研究材料,传统的基因组DNA提取的办法较多,如酚氯仿法、异硫氰酸胍法、固相吸附法、盐析法和碘化物法等。很多实验室均已选择应用试剂盒代替手工办法提取血液基因组DNA,每种办法道理不合,操作手段和提取后果也不尽雷同。
  普通认为,提取幻想的DNA 的办法应快速经济、尽可能不含无机溶剂、DNA 质量包管、可用于冷冻标本。本研究选择3 种今朝最罕见的DNA 提取试剂盒停止血液基因组DNA 的提取,并对3 种办法提取基因组DNA 的后果停止比较。琼脂糖凝胶电泳实验成果显示,3 种办法提取的基因组DNA 相对分子质量分歧,离心柱法较其他两种办法提取的DNA点样孔较干净,电泳条带较单一,无拖尾景象,注解离心柱法提取的DNA 纯度高,降解少。紫外分光光度计检测成果显示,溶液沉淀法提取的基因组DNA浓度明显高于离心柱法和磁珠法(P < 0. 05),POH等的研究也证明,溶液沉淀法具有较高的核酸提取量。根据A260 / A280 值可断定DNA 的纯度,A260 /A280 值应在1. 6 ~ 1. 9 之间DNA 纯度较好,(A260 /A280 > 1. 9,注解有RNA 污染,A260 / A280 < 1. 6,注解有蛋白质、酚等污染);A260 / A230 值用来评价样品中能否存在污染物,如碳水化合物、多肽、苯酚等,较纯洁的核酸A260 / A230 值应> 2. 0。3 种办法提取的基因组DNA 的A260 / A280 值及A260 / A230 值均在正常范围内,3 组间差别无统计学意义(P > 0. 05),注解3种办法提取的DNA 的纯度均较高,污染均较小。别的,离心柱法和磁珠法消费的时间相当,分别为1. 6和1. 5 h,在实际操作中发明,磁珠法相对节俭人力,但1 次仅能提取1 ml 血样本的基因组DNA,样本量较大年夜时须要反复实验;溶液沉淀法提取DNA 用时较长,为2. 5 h,但提取DNA 浓度相对较高。提取的基因组DNA 能否能停止下游分子生物学实验是本研究的关键。3 种办法提取的DNA 经PCR 检测均取得较好的成果,其PCR 产品条带单一且通亮,注解3 种办法提取的基因组DNA 都可较好地停止下游分子生物学实验研究。
  综上所述,溶液沉淀法、磁珠法和离心柱法DNA提取试剂盒均能满足大年夜多半的分子生物生物学研究,3种提取试剂盒各有优缺点,应用时应根据实际情况选择。如溶液沉淀法提取的DNA 产量相对较高,且可根据每份血液标本量的若干调剂用量,实用于须要提取较大年夜量DNA 的研究或实验室血液DNA标本库的建立;磁珠法的长处是提取过程全主动化,且耗时较少,但1 次最多可提取1 ml 血液中的DNA,合适1 ml 及1 ml 以下标本量的研究或须要全主动提取DNA 的研究应用;离心柱法提取的DNA 电泳条带清楚且节约时间,较合适后续实验请求较高或特别须要节约时间的研究应用。